La capacidad de Thermococcus gammatolerans para sobrellevar los daños provocados por las condiciones extremas en las que habita (elevadas temperaturas, niveles de presión, radiación, etc.), hacen de este microorganismo, un buen modelo de estudio para el análisis de sus enzimas. Por lo anterior, se seleccionó la ADN polimerasa B de T. gammatolerans (TgPolB) como modelo de trabajo para el análisis de su expresión. Dada la gran similitud estructural y el alto valor de identidad que comparte con otras ADN pol B, se buscó obtener resultados similares, bajo un sistema de expresión semejante al utilizado en otras enzimas homólogas. Para esto, se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica, utilizando como referencia la información previamente publicada para modelos similares. El primer paso fue la amplificación del gen de TgPolB a partir del ADN genómico de T. gammatolerans, el cual fue clonado en el vector pJET 1.2 Bluntcloning, y subclonado en los vectores de expresión pColdI y pET19b. Estas construcciones fueron confirmadas por medio de PCR, ensayo de doble restricción y secuenciación. Los resultados obtenidos a partir de la expresión en las cepas de Rosetta II y BL21 (DE3) con diferentes condiciones de inducción, no mostraron expresión con ninguna de las construcciones analizadas independientemente del medio de cultivo (Luria Bertani, Super broth, 2XYT), temperatura (35°C y 16°C), tiempo de inducción (4 y 16 hrs) o concentraciones de inductor utilizados (0.25, 0.5, 1 y 1.25 mM). Por su parte, las pruebas de purificación no permitieron la obtención de TgPolB, por lo que es probable que presente cambios estructurales que impidan su identificación por el método de Western-Blot. Finalmente se propone el uso de 4 estrategias de trabajo derivadas de los resultados obtenidos: 1) uso de cepas de expresión codón-plus; 2) optimización del gen; 3) subclonación preferentemente simultánea en diferentes vectores de expresión; y 4) cambiar el sistema de expresión.

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