Resumen:
La maduración de reproductores mantenidos en cautiverio y la inducción al desove por medio de la inyección de hormonas que actúan sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada, es una de las prácticas más comunes durante el cultivo de peces marinos. Sin embargo, en la gran mayoría de especies mantenidas en cautiverio, existe una elevada variabilidad en las tasas de supervivencia de larvas. Esto ha sido atribuido a la inconsistencia en la calidad de los desoves que se obtienen de reproductores mantenidos en cautiverio, la cual ha sido reportada como menor a la calidad de los desoves obtenidos de reproductores silvestres (Bromage, 1995).
La unidad Piloto de Maricultivos del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto Politécnico Nacional cuenta con la experiencia necesaria que ha permitido avances significativos en la maduración en cautiverio e inducción hormonal del huachinango del Pacífico Lutjanus peru, una especie con importancia comercial en los mercados nacional e internacional. Sin embargo, una de las principales limitantes en el desarrollo de un programa integral de cultivo de peces marinos es la alta variabilidad en las tasas de sobrevivencia durante los primeros días de desarrollo, en especial cuando se agotan las reservas vitelinas y las larvas deben iniciar la búsqueda y captura del alimento. Como resultado, las tasas de sobrevivencia larval generalmente no superan el orden del 5 %.
La calidad de los desoves depende de varias características que definen el potencial que tienen los ovocitos fecundados en producir una larva viable, capaz de sobrevivir durante los primeros días de desarrollo, y de iniciar con éxito la búsqueda y captura de presas durante la primera alimentación exógena, que es cuando se agotan las reservas vitelinas (Kjorsvik et al., 1990; Bromage, 1995; Kjorsvik et al., 2003). Esto implica que el inicio de la alimentación exógena requiere del desarrollo conjunto de estructuras asociadas con el proceso alimenticio, como la apertura de boca y ano, inicio de la actividad digestiva, pigmentación del ojo, capacidad de búsqueda y aprendizaje del comportamiento alimenticio (Hunter, 1981), así como de una fente de energía suficiente que permita la búsqueda y captura del alimento antes de morir por inanición.
La importancia del éxito en la primera alimentación es tal, que cuando no se realiza de forma adecuada, se han reportado tasas de mortalidad de hasta 60 %, comprometiendo la producción de larvas y juveniles, ya sea con fines comerciales o de investigación (Fyhn y Govoni, 1995). Con esto en mente, algunas de las investigaciones desarrolladas en nuestro laboratorio con larvas de la cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus y el huachinango del Pacífico Lutjanus peru, han permitido evaluar el efecto de factores bióticos (densidad de presas, tipo de presas) y abióticos (intensidad de luz, color del tanque) en la eficiencia alimenticia durante la primera alimentación de larvas de estas especies (Peña et al., 2004; 2005; Zavala-Leal, Tesis en desarrollo). Si bien ha sido posible caracterizar aquellas condiciones de cultivo que han permitido obtener una mayor eficiencia alimenticia, aún se registran elevadas tasas de mortalidad. Esto sugiere que no se trata de un problema de adecuación de las condiciones de cultivo, sino más bien de características inherentes a los embriones y larvas que definen el potencial de éxito alimenticio durante la primera alimentación.
Algunos reportes señalan que los parámetros metabólicos involucrados en la producción y consumo de energía como la actividad de enzimas metabólicas (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, transladolasa, piruvato kinasa, lactato deshidrogenada, fosfatasa ácida), así como la concentración de metabolitos energéticos (glucosa, fructosa, glucosa-6-fosfato) son indicadores útiles para distinguir entre huevos viales y no viables durante las primeras etapas de desarrollo embrionario, y entre larvas que presentan una mayor probabilidad de desarrollo y capacidad alimenticia (Seoka et al., 1997; Takii et al., 1997; Lahnsteiner y Patarnello, 2003; 2004a,b). Es por ello que surge la presente propuesta como una alternativa que permitirá tene una mayor comprensión de las implicaciones de los metabolitos y de las enzimas metabólicas en la calidad de los desoves obtenidos en el laboratorio.
Metodología:
Se realizarán capturas de reproductores del huachinango del Pacífico. Las capturas se harán utilizando línea y anzuelo. Se conformará un lote de 6 reproductores a una proporción 2:1 hembras machos. En el mismo sitio de pesca se realizará una evaluación del sexo de los organismos mediante canulación. Para evitar variabilidad en los desoves debido a diferencias de tamaño de los reproductores, se procurarán reproductores que presenten tallas similares: de 50 a 60 cms LT para los huachinangos.
Una vez capturados, los reproductores serán transportados a la Unidad Piloto de Maricultivos en un tanque de transporte provisto con agua de mar con hielo y aireación constante.
El lote de reproductores del huachinango será colocado en un tanque de concreto de 11 m3, las condiciones de mantenimiento son de 21°C y 35 ups con un fotoperíodo artificial de 12:12 (luz:oscuridad). El tanque forma parte de un sistema cerrado de cultivo, lo cual permite controlar y mantener constante la calidad del agua en términos de concentración de amonio, oxígeno, temperatura, nitritos, nitratos, salinidad, etc. Se realizarán evaluaciones de éstos parámetros cada tercer día para asegurar la calidad del agua. Igualmente, se realizarán sifoneos y recambios de agua cada tercer día.
La alimentación de los reproductores consiste en alimento congelado, trozos de calamar y sardina. La frecuencia alimenticia es de una vez por día, a saciedad aparente. Adicionalmente, una vez por semana se suministrará una cápsula con una mezcla de vitaminas.
La inducción al desove se realizará mediante la utilización de hormonas. Previo a la inyección hormonal, se realizará una evaluación, por canulación, del estado de madurez gonádica en los reproductores. Para esto se emplea una cánula de polietileno de 30 cm de longitud, insertándola en el oviducto. La muestra obtenida se observa en un microscopio de disección conectado a una cámara digital (Hitachi KP-D50). Se tomarán fotografías y se medirá el diámetro de los ovocitos con un analizador de imágenes (Image Pro Plus v4.5). Cuando el promedio del diámetro de los ovocitos es a 400 µm, se procede a la inducción hormonal.
Los desoves serán inducidos por inyección intramuscular de un factor liberador de gonadotropinas: el análogo del factor de liberación de la hormona luteinizante (LHRH-a) (Sigma Co.). A las hembras se les inyectará una dosis de 25 µg/kg de peso corporal en dos inyecciones, con un intervalo de 24 hrs entre cada inyección, mientras que para los machos será una sola inyección con la misma dosis (Dumas et al., 2004).
Bajo estas condiciones de inducción, los desoves se obtienen manualmente 46 hrs después de la primera inyección. Se evaluará el peso total del desove obtenido. La fertilización es artificial mezclando los gametos masculinos y femeninos durante 10 minutos. Posteriormente se separan los ovocitos fecundados viables de los no viables mediante el criterio de flotabilidad (los huevos viables flotan y los no viables se precipitan) en una probeta de 5 lt. Se evaluará el porcentaje de fecundación (ovocitos viables/ovocitos producidos). Los ovocitos viables serán separados en tres porciones iguales y cada una será colocada en tolvas de incubación cilindrocónicas de 120 Lts con agua de mar filtrada y esterilizada. Se realizará la incubación a 26° C. Salinidad de 35 ups, a oscuridad total, con flujo de agua continuo y aireación constante. Posteriormente se tomarán muestras durante diferentes etapas de desarrollo para hacer las diferentes evaluaciones en cada desove.
Se realizarán muestreos de ovocitos sin fecundar, así como de ovocitos viables y no viables. Igualmente, se realizarán cuatro muestreos a diferentes etapas del desarrollo embrionario: durante las divisiones tempranas (2-8 blastómeros), en la etapa de blástula temprana, durante la etapa de gástrula, y antes de la eclosión. Además, a partir del momento de la eclosión, se realizarán 5 muestreos: a las 0 (eclosión), 24 y 48, h después de la fertilización. A continuación se detallan el número de muestras y las diferentes evaluaciones morfométricas y bioquímicas a realizarse.
Previo a la fertilización, se tomarán 3 muestras aleatorias de 30 ovocitos c/u y se tomarán fotografías digitales con el analizador de imágenes Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, MD, USA). Posteriormente, se medirá el diámetro de los ovocitos y del glóbulo de aceite.
Una vez que se haya cerrado el blastoporo, se tomarán 6 muestras aleatorias de 100 ovocitos y se colocarán incubadores de plástico de 1 L con agua de mar filtrada y esterilizada con UV a 26° C y salinidad de 35 ups con aireación constante. Los huevos de 3 incubadores permanecerán hasta el momento de la eclosión y se fijarán con formol al 4 %. Posteriormente, con la ayuda de un microscopio de disección, se evaluarán el porcentaje de eclosión y el número de eleuteroembriones presentes en la muestra. Se evaluará el porcentaje de huevos no eclosionados, y la presencia de eleuteroembriones con malformaciones. Adicionalmente se estimará la tasa de sobrevivencia de las larvas a la primera alimentación en los otros 3 incubadores.
Actividad enzimática metabólica.
Se obtendrán muestras por duplicado por cada actividad enzimática a determinar. Cada muestra consistirá en 260 huevos y 300 larvas, los cuales serán enjuagados con agua destilada y colocados en tubos eppendorf de 2 ml. Todas las muestras se preservarán a -80° C y posteriormente serán liofilizadas durante 24 hrs y mantenidas a -80° hasta el momento de su análisis. Se determinara la actividad de las enzimas: fosfatasa acida (E.C.3.1.3.2), glucosa-6-fosfatasa (E.C.3.1.3.9), transaldolasa (E.C.2.2.1.2) y lactato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.27). Al momento del análisis, a cada una de las muestras se les agregarán 0,6 ml de Tris buffer 100 mM/l, a un pH 7,5; por centrifugación se obtendrán los sobrenadantes y se incubaran en sustratos específicos para determinar la concentración de las enzimas mediante espectrofotometría. Los sustratos específicos varían dependiendo de la enzima a evaluar: para fosfatasa ácida p-nitrofenil-fosfato a una concentración de 11 mmol/L a un pH de 4.4; para glucosa-6-fosfatasa, glucosa-6-fosfato 200 mmol/L pH de 6.5; para transaldolasa, fructosa-6-fosfato a una concentración de 2.7 mmol/L y pH de 7.6; para lactato deshidrogenasa, piruvato a una concentración de 0.20 mmol/L y pH de 7.6. Las técnicas son las reportadas por Bergmeyer (1985).
Concentración de metabolitos
Se obtendrán muestras por duplicado por cada actividad enzimática a determinar. Cada muestra consistirá en 260 huevos y 300 larvas, los cuales serán enjuagados con agua destilada y colocados en tubos eppendorf de 2 ml. Todas las muestras se preservarán a -80° C y posteriormente serán liofilizadas durante 24 hrs y mantenidas a -80° hasta el momento de su análisis. Se determinará la concentración de los metabolitos energéticos: glucosa-6-fosfato, fructosa, glucosa y ácido siálico. Las técnicas específicas son las reportadas por Bergmeyer (1985).
Referencias
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